Nationell plattform för nanosäkerhet – Forum för samverkan och kunskapsresurs vid Karolinska Institutet på uppdrag av regeringen

Det finns i dag många publicerade artiklar som rapporterar om nanomaterials skadliga effekter på DNA – så kallade genotoxiska effekter. Men vad krävs för att en studie om genotoxiska effekter av nanomaterial ska vara användbar ur ett regulatoriskt perspektiv? Och vad är slutsatsen från de tillförlitliga studierna? Detta diskuterades i en sammanställning av flera experter inom fältet som nyligen publicerades i tidskiften ”Particle and Fibre Toxicology”.

Antalet publikationer inom området som handlar om genotoxiska effekter av nanomaterial har ökat under det senaste årtiondet. Det finns dock en ökad förståelse av att det kan finnas vissa begränsningar i de publicerade studierna, dels för att nanomaterialen inte karakteriserats tillräckligt, dels för att det kan finnas begränsningar med toxikologiska metoder som ursprungligen utformades för lösliga kemikalier. Därför är det inte säkert att all data är tillförlitlig eller relevant ur ett regulatoriskt perspektiv. I en systematisk sammanställning undersökte forskarna i vilken utsträckning studier som handlar om genotoxicitet av nanomaterial kan anses vara relevanta med nuvarande standarder för tillförlitlighet. De diskuterade också vad som behövs för en studie vara användbar ur regleringssynpunkt. Forskarna fokuserade på två grupper av material nämligen nanofibrer (inklusive kolnanorör) och metallhaltiga nanopartiklar och man beslutade sig för att inte inkludera studier som använt bakterieceller (då de inte tar upp partiklarna på samma sätt som däggdjursceller) eller in vitro kometmetoden (av olika anledningar, tex brist på standardisering). För att bedöma studierna som inkluderades användes kriterier baserat på den så kallade ”GUIDEnano-metoden” som består av två olika poäng relaterat till 1. huruvida karakterisering kan anses fullständig och 2. studiens tillförlitlighet. När det gäller karakterisering ansågs det nödvändigt beskriva partiklarna i deras ursprungliga tillstånd samt även efter de blandats med cellmedium. Vidare ansågs kemisk sammansättning, storlek, form och yt-egenskaper vara nödvändiga. Studiens tillförlitlighet handlar om att säkerställa en adekvat beskrivning av modellsystemet och studiedesignen, korrekt resultatdokumentation och bedömning av resultatets rimlighet.

Förutom dessa aspekter så hade forskarna en rad kriterier för de olika metoderna. För analys av mikrokärnor in vitro krävdes tex att bakgrundsfrekvenser måste rapporteras, att de positiva kontrollerna gav en statistiskt signifikant ökning och att cytotoxiska effekter bedömdes. En annan viktig aspekt för nanomaterial är att ämnet cytochalasin B, som används för att möjliggöra identifiering av delande celler, tillsätts tidigast efter 6h efter exponeringen börjat då upptag av partiklar annars kan hämmas. En intressant fråga är vilken maxdos som bör användas för material som inte är speciellt cytotoxiska och här ansåg forskarna att 250 µg/mL kan vara rimligt. Den mest kritiska frågan relaterad till in vivo-bedömningen var att säkerställa att tillräcklig mängd av materialet har nått målvävnad.

Resultatet när det gäller tillförlitlighet visade att den främsta anledningen till att en studie inte ansågs tillförlitlig var bristande karakterisering. Antalet studier som ansågs tillförlitliga var i slutändan för metallhaltiga nanopartiklar 20 stycken in vitro studier och 15 in vivo studier (15% och 18% av de totala antalet inom gruppen) och för nanofibrerna var det 7 stycken in vitro och 12 in vivo studier (12% och 33% av totalt). En vanliga brist bland in vitro studierna var brist på tillförlitlig cytotoxicitetsdata. En vanlig brist i in vivo studierna var antal celler som analyserades, tex är kromosomabberationer ovanliga och man bör med fördel analysera 200 celler som är i metafas. En annan brist var att studien inte kontrollerade att tillräcklig mängd nanomaterial fanns i målorganet. Även om inhalation anses vara den mest relevanta exponeringsvägen för människor så var det bara två studier på metallhaltiga nanopartiklar som använde exponering via lungan medan det var elva avseende nanofibrerna.

Resultatet visade att de flesta studier var positiva och alltså visade en genotoxisk effekt. Det är dock svårt att veta hur mycket som är så kallad ”publication bias” dvs att det är svårare att publicera studier som inte visar någon effekt. När det gäller metallhaltiga nanopartiklar så fann forskarna flest tillförlitliga studier på titandioxid (TiO₂) och silver (Ag) nanopartiklar och de flesta visade på genotoxiska effekter. För ZnO är datan osäker då genotoxisk effekt sammanföll med cytotoxicitet. Studierna visade på ”primär genotoxicitet” (alltså att partikeln i sig orsakar effekten), men det finns indikationer på att effekten inte behöver vara en direkt interaktion med DNA utan mer indirekt, tex via oxidativ stress. En sådan slutsats är viktig för det skulle kunna tyda på att det finns ett tröskelvärde. När det gäller nanofibrer var resultaten varierande. Forskarnas slutsats blev att från de tillförlitliga studierna var det svårt att avgöra om nanofibrer (de flesta som studerades var kolnanorör) är genotoxiska. Forskarna poängterade också bristen på studier som använt däggdjursceller för att göra genmutationsanalyser (tex hprt-assay) och att riktlinjer (test guidelines) när det gäller toxikokinetik är under utveckling och det är viktigt för att kunna utvärdera genotoxicitet (in vivo). Data i olika databaser, så som ”NanoInformaTIX” utvärderades också och man konstaterade bland annat att det fanns väldigt mycket data men att den ibland inte var tillräckligt harmoniserad (tex samma metoder benämns olika) och att det kan vara en utmaning för externa personer, så som personer från myndigheter, att ta del av informationen.

Forskarna avslutar med att konstatera att den viktigaste barriären mellan personer som arbetar med ett regulatoriskt perspektiv och forskarna är bristen på nanospecifika riktlinjer för både genotoxicitetsanalyser och annan information, såsom karakterisering och toxikokinetik för nanomaterial.

Siivola KK, Burgum MJ, Suárez-Merino B, Clift MJD, Doak SH, Catalán J. A systematic quality evaluation and review of nanomaterial genotoxicity studies: a regulatory perspective. Part Fibre Toxicol. 2022 Sep 14;19(1):59. doi: 10.1186/s12989-022-00499-2. PMID: 36104711; PMCID: PMC9472411.

Källa: Hanna L Karlsson, Docent, KI
Åsikterna i detta referat är expertens och representerar inte nödvändigtvis SweNanoSafes ståndpunkt.